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Caracterización molecular del gen GBA en pacientes cubanos con enfermedad de Gaucher.

Molecular characterization of the GBA gene in Cuban patients with Gaucher disease.

Ixchel López Reyes,I Antonio Alejandro Esperón Álvarez,II Kalia Lavaut Sánchez,III Arelys Puerta Díaz,IV Elvia Nelemi Santos González,V Tamara Rubio González,VI Lídice Reyes Navarro,VII Manuel Gómez Martínez,VIII Arlet María Acanda de la Rocha,IX Teresa Collazo Mesa.X

I Licenciada en Biología. Investigadora Agregada. Centro Nacional de Genética Médica. E-Mail: ixchel@cngen.sld.cu

II Licenciado en Biología. Investigador Agregado. Centro Nacional de Genética Médica.

III Doctora en Medicina. Especialista de Primer Grado en Medicina General Integral y en Genética Clínica. Instituto de Hematología e Inmunología.

IV Licenciada en Bioquímica.

V Licenciada en tecnología de la salud. Master en Ciencias. Centro Nacional de Genética Médica.

VI Doctora en Medicina. Especialista de Segundo Grado en Medicina General Integral y en Genética Clínica. Centro Provincial de Genética Médica de Santiago de Cuba.

VII Técnico en Química Analítica. Centro Nacional de Genética Médica.

VIII Técnico en Química Analítica. Centro Nacional de Genética Médica.

IX Licenciada en Bioquímica.

X Licenciada en Bioquímica. Doctora en Ciencias Médicas. Investigadora Titular. Centro Nacional de Genética Médica.

Resumen

La enfermedad de Gaucher (EG) es el trastorno relacionado con el depósito lisosomal de mayor prevalencia a nivel mundial. Presenta un patrón de herencia autosómico recesivo y se origina fundamentalmente por mutaciones en el gen GBA, localizado en la región cromosómica 1q21, que codifica la enzima lisosomal ácido β-glucosidasa. En el presente trabajo se describen los resultados obtenidos por el laboratorio de Biología Molecular del Centro Nacional de Genética Médica, La Habana, Cuba, en el análisis del gen GBA en pacientes cubanos con sospecha clínica de la EG. Fueron estudiados siete pacientes no emparentados, caracterizados clínicamente y con diagnóstico bioquímico y/o histológico. Se realizó el estudio de cuatro mutaciones mediante amplificación de secuencias del gen GBA y digestión con enzimas de restricción. En los casos en que ninguna de las mutaciones estudiadas por análisis directo estuvo presente, las muestras se sometieron a cribado de mutaciones y secuenciación de ADN. El análisis molecular permitió identificar la mutación presente en el 100% de los cromosomas analizados. Fueron detectadas las mutaciones L444P, N370S e I403T. El presente estudio estableció una metodología para el diagnóstico por biología molecular de la enfermedad de Gaucher en la población cubana que permite ofrecer un servicio diagnóstico efectivo y rápido en pacientes con sospecha de la enfermedad y en posibles portadores.

Palabras clave: Enfermedad de Gaucher, gen GBA, L444P, N370S, correlación genotipo-fenotipo.

Abstract

Gaucher disease (GD) is the most prevalent lysosomal storage disorder worldwide. It presents an autosomal recessive inheritance pattern and originates mainly from mutations in the GBA gene, located in the 1q21 chromosomal region, which encodes the lysosomal enzyme β-glucosidase. The present work describes the results obtained by the Molecular Biology Laboratory of the National Center of Medical Genetics, Havana, Cuba, in the analysis of the GBA gene in Cuban patients with clinical suspicion of GD. Seven unrelated patients, clinically characterized and with biochemical and/or histological diagnosis, were studied. Four mutations were studied by amplifying GBA gene sequences and restriction enzyme digestion. In cases where none of the mutations studied by direct analysis were present, the samples were subjected to mutation screening and DNA sequencing. Molecular analysis allowed to identify the mutation present in 100% of the analyzed chromosomes. Mutations L444P, N370S and I403T were detected. The present study established a methodology for the diagnosis by molecular biology of Gaucher disease in the Cuban population that allows to offer an effective and rapid diagnostic service to patients with suspected disease and to possible carriers.

Keywords: Gaucher disease, GBA gene, L444P, N370S, genotype-phenotype correlation.

Introducción

La enfermedad de Gaucher (EG) es el trastorno relacionado con el depósito lisosomal de mayor prevalencia a nivel mundial. Presenta un patrón de herencia autosómico recesivo y se origina fundamentalmente por mutaciones en el gen GBA, localizado en la región cromosómica 1q21. Este gen codifica la enzima ácido β-glucosidasa, una proteína de la membrana lisosomal que cataliza la ruptura del enlace β-glucosídico de la glucosilceramida y produce ceramida y glucosa.1 La glucosilceramida es un intermediario del metabolismo de glucoesfingolípidos complejos que se encuentra en las membranas biológicas de la mayoría de los tejidos del organismo. Su acumulación, principalmente en células del linaje monocito-macrófago, provoca que las células aumenten de tamaño, se desplace el núcleo hacia la membrana citoplasmática y el citoplasma adquiera apariencia fibrilar, características utilizadas para identificarlas como células Gaucher. Estas células liberan citoquinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias, que contribuyen a la patogenia de la enfermedad.2 Otras líneas celulares como las de piel y sistema nervioso pueden verse afectadas en los pacientes, lo cual influye en el amplio rango de fenotipos que comprenden desde la enfermedad letal perinatal hasta la forma asintomática.3 Tradicionalmente se ha clasificado la enfermedad en tres tipos clínicos, teniendo en cuenta la presencia o no de síntomas neurológicos, la severidad y la edad a la que aparece: EG tipo I (no neurológica), EG tipo II (neurológica aguda) y EG tipo III (neurológica crónica).

La EG presenta una amplia heterogeneidad alélica y hasta el momento más de 400 mutaciones han sido reportadas en el gen GBA. No obstante, las dos mutaciones que prevalecen en la mayoría de la poblaciones son c.1226A>G (N370S) y c.1448T>C (L444P). Aunque la correlación genotipo-fenotipo no es exacta, se han establecido patrones que permiten pronosticar la evolución de la enfermedad y proporcionar un tratamiento adecuado a los pacientes desde edades tempranas, para prevenir el desarrollo de complicaciones irreversibles y optimizar el crecimiento y desarrollo de los niños.4,5 Por ejemplo, un fenotipo leve está asociado con la variante alélica N370S.6 Mientras que la mutación L444P, se asocia con la EG tipo II y III, en ausencia de una variante alélica leve.7,8

En Cuba, la caracterización molecular del gen GBA se inició en el año 2008, en el Centro Nacional de Genética Médica (CNGM), aunque previamente se realizó el estudio molecular de dos pacientes en el Instituto de Biología Molecular y Celular de Portugal y la Fundación Española para el Estudio y Terapéutica de la Enfermedad de Gaucher (FEETEG).9 En el presente trabajo se describen los resultados obtenidos por el laboratorio de Biología Molecular del CNGM, en el análisis del gen GBA en pacientes cubanos con sospecha clínica de la EG.

Métodos

La muestra de estudio estuvo conformada por siete pacientes cubanos no emparentados, diagnosticados clínica, bioquímica y/o histológicamente con la EG.

Para establecer la metodología de diagnóstico molecular en los pacientes cubanos con la EG, se tuvo en cuenta la contribución de distintas poblaciones al origen étnico de la población cubana. Las poblaciones de África Central y Occidental, no han sido caracterizadas hasta el momento por técnicas moleculares para el gen GBA. Por ello se seleccionaron para el análisis las mutaciones más frecuentes en la población española: N370S (50,2%), L444P (18,4%), 55del (2,8%) y G377S (2,3%).10 Las dos primeras variantes alélicas, además, coinciden con las mutaciones más frecuentes a nivel mundial.11

Se emplearon como controles positivos de las mutaciones N370S (en estado heterocigótico) y L444P (en estado homocigótico) muestras de dos pacientes que fueron estudiados en el Instituto de Biología Celular y Molecular de Portugal y por la Fundación Española para el Estudio y Terapéutica de la Enfermedad de Gaucher (FEETEG). El consentimiento informado fue obtenido de los participantes en el estudio, de acuerdo al protocolo aprobado por el comité de ética del Centro Nacional de Genética Médica.

El ADN genómico fue aislado a partir de sangre periférica mediante métodos estándares.12 Se empleó la técnica de PCR-RFLP para detectar las mutaciones N370S, L444P y G377S según lo descrito en la literatura.13-15 Para la variante 55del se utilizó la diferencia en los tamaños de los fragmentos obtenidos por la técnica de PCR.16 El gen GBA se amplificó con oligonucleótidos específicos que no amplifican el pseudogen. A partir de este fragmento de 7,5 kb fueron amplificados individualmente los exones y secuencias intrónicas adyacentes por PCR-anidado.17 Para detectar posibles alelos de recombinación, a las muestras que ya tenían definido su genotipo se les realizó el cribado de mutaciones, con excepción de los pacientes 6 y 7, cuyos análisis no habían concluido al momento de la realización de este trabajo.

Cuando las muestras resultaron negativas para las mutaciones estudiadas por análisis directo, se sometieron a cribado de mutaciones mediante la técnica de PCR-SSCP. En caso de localizarse una variante electroforética fueron sometidas, entonces, a la secuenciación bidireccional de ADN por el método de Sanger. Para la corrida electroforética de la secuenciación se utilizó el secuenciador automático ALF express II (Amersham Pharmacia Biotech). Los resultados fueron analizados mediante el programa informático del equipo y comparados con la secuencia de ADN de referencia del gen GBA (Gen Bank: NG_009783.1) mediante la herramienta de alineamiento de secuencias BLAST (Basic Local Alignment Search Tool: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). La mutación detectada por secuenciación fue validada mediante la técnica PCR-RFLP. Para predecir la patogenicidad de las variantes genéticas encontradas se realizó el análisis para evaluar la sustitución de aminoácido mediante las herramientas bioinformáticas SIFT,18 PolyPhen-2,19 SNPeffect,20 Mutation Taster21 y SNPs3D.22

Cuando dos mutaciones se detectaron en un paciente se consideraron alelos separados. Lo que se verificó al identificar la mutación en los padres, hermanos o hijos de los pacientes. Con excepción del paciente 7, pues no contamos con miembros de su familia para el análisis.

Resultados
De los siete pacientes estudiados, cinco fueron clasificados como EG tipo I y dos como EG tipo III (Tabla 1).

El diagnóstico molecular permitió identificar la mutación presente en el 100% de los alelos (14 alelos) del gen GBA analizados (Tabla 2). De las tres mutaciones encontradas, dos, L444P (7 de 14 alelos) y N370S (6 de 14 alelos), están presentes en el 92,86% de los alelos. Las variantes patogénicas G377S y 55del no fueron detectadas.

Se identificó el genotipo en los siete casos índice estudiados (Tabla 1). El análisis directo de las mutaciones permitió determinar las variantes presentes en seis de ellos (un genotipo N370S/N370S, tres N370S/L444P y dos L444P/L444P). El paciente restante, presenta en un alelo la mutación N370S y en el otro alelo una variante no descrita previamente, I403T,23 que fue hallada mediante cribado y secuenciación de ADN en el exón 9 de GBA (Figura 1). El análisis bioinformático de esta mutación mediante los programas SIFT, PolyPhen-2, SNPeffect, Mutation Taster y SNPs3D la evalúa, en todos los casos, como posiblemente patogénica (Tabla 3).

Discusión

La variedad de mutaciones reportadas en el gen GBA, más de 400 hasta la fecha dificulta el estudio molecular de los pacientes con la EG. No obstante, el análisis molecular del gen GBA permitió identificar el genotipo de los pacientes cubanos en estudio. Aunque debido al tamaño de la muestra analizada, siete pacientes, no podemos referirnos a la frecuencia de las mutaciones detectadas, exponemos, para una comparación preliminar, la distribución de los alelos mutados en pacientes de poblaciones afines.

Por ejemplo, estudios en pacientes españoles refieren gran heterogeneidad en el gen GBA, con una de las mayores frecuencias de la mutación N370S para Europa y una de las menores frecuencias de la mutación L444P a nivel mundial. Ambas variantes se identifican en el 68,7% de los alelos mutados en España.10

En otras poblaciones hispanoamericanas también se ha detectado gran heterogeneidad del gen GBA como resultado del mestizaje de las poblaciones de la región (Tabla 4). Por ejemplo, en Brasil aunque las dos mutaciones más comunes, N370S y L444P, cubren el 74,1% de los alelos mutados existe un 25,9% de alelos en los que se ha identificado una mutación con menor frecuencia o mutaciones esporádicas no caracterizadas.14 En Argentina el 67,8% de los alelos mutados corresponde a las variantes N370S y RecNciI, mientras el 32,2% restante concierne a mutaciones con menor frecuencia o mutaciones esporádicas no caracterizadas. La variante L444P, que usualmente tiene una elevada frecuencia, en la población argentina solo representa el 6,5% de los 62 alelos mutados.24 Mientras en Colombia el 63,1% de los alelos mutados corresponde a las variantes N370S y L444P con un 36,9% de alelos en los que se ha detectado una mutación con menor frecuencia.25

Sin embargo, en los pacientes cubanos estudiados, hasta ahora, no se detecta la heterogeneidad descrita en otras poblaciones para el gen GBA, sino que indican una alta frecuencia de las dos mutaciones más comunes a nivel mundial. La elevada prevalencia de las variantes N370S y L444P en la población de España posiblemente haya influido en que estas mutaciones abarquen la mayor parte del espectro de mutaciones de la población cubana.

Dado el mestizaje de la población cubana26 y el hecho de que los pacientes proceden de distintas regiones del país no es posible un efecto fundador, como sucede en poblaciones cerradas. Por ejemplo, la judía de Europa, donde la mutación N370S es la más frecuente27 o la Norrbottnian de Suiza causada por homocigosis para la mutación L444P.28

En este estudio las relaciones genotipo–fenotipo establecidas confirman el papel protector de la mutación N370S en el desarrollo de complicaciones neurológicas,10 así como que esta variante en estado homocigótico se asocia con manifestaciones leves de la enfermedad.

El paciente heterocigótico compuesto para las mutaciones N370S/I403T fue clasificado como tipo I (Tabla 1). Esta mutación se localización en el exón 9 del gen GBA que codifica del residuo aminoacídico 370 al 424, y por ello tiene un papel fundamental en la formación del dominio I y del dominio catalítico de la enzima.29 El análisis bioinformático con distintas herramientas predice su carácter patológico.

Los pacientes que tenían un mismo genotipo (tres N370S/L444P y dos L444P/L444P) presentaron variación fenotípica, lo que confirma que otros factores genéticos y ambientales influyen en la expresión clínica de la EG.30

El genotipo L444P/L444P es el que con mayor frecuencia se encuentra asociado a la EG tipo III.31 En nuestro estudio uno de los dos individuos homocigóticos para la variante L444P, clasificados como tipo III, aún no ha desarrollado manifestaciones neurológicas, pero estas pueden aparecer durante el curso de la enfermedad (Tabla 1).

Conclusiones

La metodología seguida para el análisis molecular del gen GBA, PCR-RFLP y PCR-SSCP-Secuenciación, resultó efectiva para la confirmación del diagnóstico clínico de la enfermedad en los siete pacientes analizados. Se determinó el genotipo GBA de los pacientes estudiados y se identificaron tres mutaciones relacionadas con la EG. Estos resultados contribuyen al establecimiento de las bases moleculares de la EG en los pacientes cubanos. Además, permiten pronosticar la evolución de la enfermedad de acuerdo al genotipo del individuo enfermo, y proporcionar un tratamiento adecuado a estos desde edades tempranas, mejorando así su calidad de vida.

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