Hábito de fumar, anticuerpos antipéptido de fibrinógeno citrulinado y actividad clínica de la artritis reumatoide

Goitybell Martínez Téllez; Bárbara Torres Rives; Yaima Zúñiga Rosales; Maité Martiatu Hendrich; Minerva Matarán Valdes

Artículo original

Hábito de fumar, anticuerpos antipéptido de fibrinógeno citrulinado y actividad clínica de la artritis reumatoide

Smoking, anti-citrullinated fibrinogen peptide antibodies and clinical activity of rheumatoid arthritis

Goitybell Martínez Téllez¹
Bárbara Torres Rives¹
Yaima Zúñiga Rosales¹
Maité Martiatu Hendrich¹
Minerva Matarán Valdes¹

¹ Centro Nacional de Genética Médica. La Habana, Cuba.

RESUMEN

Introducción: La relación entre el hábito de fumar y los cambios epigenéticos puede afectar el funcionamiento de las células vinculadas a la patogenia en la artritis reumatoide y llevar a la generación de autoanticuerpos.
Objetivo: Establecer la relación entre el hábito de fumar, la presencia de anticuerpos contra un péptido del fibrinógeno citrulinado y la severidad de la enfermedad en pacientes cubanos con artritis reumatoide.
Métodos: Se incluyeron 148 pacientes cubanos con artritis reumatoide del Centro Nacional de Reumatología. Se determinó la asociación mediante χ² entre el hábito de fumar y la presencia de anticuerpos contra un péptido del fibrinógeno citrulinado determinados mediante un inmunoensayo, así como la relación de estos anticuerpos con el índice de actividad clínica de la enfermedad y la positividad de proteína C reactiva.
Resultados: Concentraciones de anticuerpos superiores a 40 U/mL, se asociaron al hábito de fumar en los pacientes estudiados (p= 0,0339). Se observó asociación entre concentraciones de anticuerpos superiores a 40 U/mL y actividad clínica moderada o elevada (p= 0,0382), así como con la positividad de proteína C reactiva (p= 0,0002).
Conclusiones: El hábito de fumar está asociado a concentraciones elevadas de anticuerpos contra un péptido del fibrinógeno citrulinado, vinculados a una mayor severidad clínica de la enfermedad en pacientes cubanos con artritis reumatoide.

Palabras clave: hábito de fumar; artritis reumatoide; anticuerpos; fibrinógeno citrulinado.

ABSTRACT

Introduction: The relationship between smoking and epigenetic changes may affect the functioning of cells associated to the pathogenesis of rheumatoid arthritis and lead to the generation of autoantibodies.
Objective: Determine the relationship between smoking, the presence of antibodies against a citrullinated fibrinogen peptide, and the severity of rheumatoid arthritis in Cuban patients.
Methods: A study was conducted of 148 Cuban patients with rheumatoid arthritis cared for at the National Rheumatology Center. X² distribution was used to determine the association between smoking and the presence of antibodies against a citrullinated fibrinogen peptide detected by immunoassay, as well as the relationship of these antibodies to the index of clinical activity of the disease and to C-reactive protein positivity.
Results: Antibody concentrations above 40 U/ml were associated to smoking in the patients evaluated (p= 0.0339). An association was found between antibody concentrations above 40 U/ml and moderate or high clinical activity (p= 0.0382) and C-reactive protein positivity (p= 0.0002).
Conclusions: Smoking is associated to high concentrations of antibodies against a citrullinated fibrinogen peptide, which is in turn associated to greater clinical severity of the disease in Cuban patients with rheumatoid arthritis.

Keywords: smoking; rheumatoid arthritis; antibodies; citrullinated fibrinogen.

Recibido: 13/02/2018
Aceptado: 18/10/2018

INTRODUCCIÓN

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune sistémica, compleja, que se caracteriza por inflamación sinovial, erosiones óseas y destrucción articular.^(1,2)

Aunque no se han determinado los factores primarios que desencadenan esta enfermedad, existen evidencias que indican que la inflamación sinovial ocurre como resultado de complejas interacciones medioambientales y genéticas.^(3,4) En este contexto, los antígenos propios con modificaciones postraduccionales, como la citrulinación (conversión enzimática del residuo arginina a citrulina en las proteínas), son presentados al sistema inmune y conducen a la ruptura de la tolerancia inmunológica.^(3,4,5,6)

Los grandes avances de la tecnología, como la secuenciación amplia del genoma, han permitido identificar algunas variantes genéticas en poco más de 100 genes, que aportan de un 50 a un 60 % el riesgo de padecer la enfermedad.^(3,7) El principal factor genético asociado a la AR está vinculado a la presencia de diversos alelos de antíge nos leucocitarios humanos (HLA, del inglés: human leucocite antigen) del HLA-DRB1, que codifican para una secuencia de cinco aminoácidos conocidos como epítopo compartido.^(3,5) No obstante, se ha observado que la concordancia entre gemelos idénticos es solamente de un 12 a un 15 %, y un estudio reciente en gemelos mono y dicigóticos sugiere, que la exposición a factores medioambientales tiene mayor influencia en la susceptibilidad a la AR que la predisposición genética.⁽⁷⁾

Los mecanismos epigenéticos son modificaciones que llevan al remodelamiento de la cromatina y a cambios en la expresión génica que, al ser heredables y adquiridos a través de la vida, constituyen un puente para la integración de la contribución genética y medioambiental al riesgo de padecer esta enfermedad.^(2,7,8,9)

El hábito de fumar, uno de los factores más vinculados a la AR y a los anticuerpos frente a proteínas citrulinadas, puede desencadenar la autoinmunidad, a través de mecanismos epigenéticos como la metilación del ADN y la acetilación de histonas. ^(5,7,8,9,10) Por otra parte, en la AR los fibroblastos sinoviales son los mediadores primarios de la destrucción del cartílago y participan en la maduración de los linfocitos B y la producción local de autoanticuerpos.^(7,11) Se han demostrado cambios en la metilación del ADN y la acetilación de histonas en fibroblastos sinoviales de pacientes con AR.⁽⁷⁾

El objetivo de este trabajo fue establecer la relación entre el hábito de fumar, la presencia de anticuerpos contra un péptido del fibrinógeno citrulinado (anti-PFC) y la severidad de la enfermedad en pacientes cubanos con AR.

MÉTODOS

Se realizó un estudio analítico transversal. La muestra estuvo constituida por 148 pacientes, mayores de 18 años, de ambos sexos, atendidos por un reumatólogo en el Centro Nacional de Reumatología durante el periodo de enero de 2014 a enero de 2017 y que cumplieron los criterios para el diagnóstico de la AR establecidos por el Colegio Americano de Reumatología y la Liga Europea contra el Reumatismo.⁽¹²⁾ Las características demográficas edad, sexo, tiempo de diagnóstico y hábito de fumar, así como los parámetros clínicos, fueron recolectadas en planillas de recolección de datos. Para el desarrollo de la investigación se tuvieron en cuenta los principios éticos enunciados en la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial, para las investigaciones médicas en seres humanos.⁽¹³⁾La investigación fue aprobada por el Comité de Ética del Centro Nacional de Genética Médica.⁽¹²⁾

Determinación de autoanticuerpos

Se realizó un inmunoensayo enzimático de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, del inglés: enzyme linked immunosorbed assay) de tipo indirecto. Se sensibilizaron las placas (Thermo scientific, Dinamarca) con un péptido de fibrinógeno citrulinado obtenido mediante síntesis química, a la concentración de 10 µg/mL en solución amortiguadora fosfato salina 0,15 M, pH = 7,2 (PBS). Se incubó 16 h en cámara húmeda a 4 °C. Se lavó 3 veces con solución amortiguadora PBS y Tween 20 al 0,05 % en un lavador de ELISA (SUMA, Cuba) añadiendo 200 μL en cada pocillo. Se realizó el bloqueo con albúmina de suero bovino (BSA) (SIGMA, USA) diluida al 2 % en solución amortiguadora PBS, se incubó 1 h en cámara húmeda a 4 °C y luego se realizó el lavado nuevamente. Se añadieron por triplicado las muestras de suero de los pacientes, diluidas 1/100 en solución amortiguadora PBS con 2 % de BSA y 0,05 % de Tween 20. Se adicionó el suero estándar en diluciones dobles seriadas desde la concentración de 120 U/mL hasta 6,2 U/mL. Se incubó a 4 °C durante 1 h en cámara húmeda. Luego de otro paso de lavado se añadió el conjugado anti IgG con peroxidasa de rábano picante (Dako cytomation, Dinamarca), 100 μL en cada pocillo a la dilución 1/8000 en solución PBS con Tween 20 al 0,05 %. Se incubó 1 h a 4 °C y se lavó la placa. Se añadieron 10 mg de dihidrocloruro de orto fenilendiamina (SIGMA, USA) y 10 µL de peróxido de hidrogeno (MERCK, Alemania) diluidos en 11 mL de solución amortiguadora fosfato citrato y se incubó 30 min de 20 a 25 °C. Se detuvo la reacción con ácido sulfúrico 3 M (MERCK, Alemania), añadiendo 50 μL en cada pocillo y se leyó la absorbancia a 492 nm con un lector de micro ELISA PR-521 (SUMA, Cuba). Los resultados se expresaron en U/mL utilizando un ajuste logarítmico para la curva de calibración.

Determinación de la actividad clínica de la enfermedad

Se determinó la velocidad de sedimentación globular (VSG) como la medida de la caída de los eritrocitos, en 2 mL de sangre anticoagulada con 0,5 mL de citrato de sodio al 3,8 %, para el cálculo del índice de actividad de la enfermedad DAS 28 basado en el recuento de 28 articulaciones dolorosas y tumefactas mediante la siguiente fórmula:^(12,14)

La evaluación global del paciente se midió en una escala entre 0 y 10. Se consideró el DAS 28: normal (≤ 2,6), bajo (> 2,6 ≤3,2), moderado (> 3,2 ≤ 5,1) y elevado (> 5,1).^(12,14)

La proteína C reactiva se determinó mediante la técnica cualitativa de aglutinación en látex (Diagnostic Automation/Cortez Diagnostics, EUA).

Análisis estadístico

Se utilizaron los programas Statistica 7.0 y EPIDAT 3.1. Las variables cualitativas se expresaron como frecuencia y porcentajes. Las variables cuantitativas con distribución diferente a la normal se expresaron como mediana y rangos. Se calculó el estadígrafo χ ², con corrección de Yates para frecuencias inferiores a 5, se estimó el Odd Ratio (OR) como magnitud de asociación y se consideró p < 0,05 como significación estadística.

RESULTADOS

En este estudio se observó una alta frecuencia del sexo femenino (79,7 %) en los pacientes con AR.

Como se recoge en la tabla, la mayor parte de los pacientes tuvieron DAS 28 elevado y positividad de proteína C reactiva.

La mediana de la edad fue 49 años en un rango de 16 a 86 años y la mediana de la duración de la enfermedad fue 1 año, en un rango de 0 a 50 años. Del total de pacientes, 92 (62,2 %) tuvieron menos de 1 año de diagnóstico.

Al analizar la influencia del hábito de fumar en las concentraciones de anticuerpos anti-PFC (Fig. 1), se observó que 13 pacientes (76,5 %) tuvieron anticuerpos a concentraciones superiores a 40 U/mL (2 veces el valor de corte) de 17 pacientes con hábito de fumar y 60 (45,8 %) de 131 pacientes no fumadores. Concentraciones de anticuerpos anti-PFC superiores a 40 U/mL, se asociaron al hábito de fumar en los pacientes estudiados con AR (x²= 4,5; OR = 3,8; IC = 1,2-12,4; p = 0,0339), con una prevalencia en expuestos de 76,5 %.

Se observó que de 134 pacientes con actividad clínica moderada o elevada (DAS 28 mayor a 3,2), 73 (54,5 %) tuvieron anticuerpos anti-PFC a concentraciones superiores a 40 U/mL (Fig. 2) y solamente hubo 3 pacientes (21,4 %) de 14 con actividad clínica baja o normal (DAS 28 menor e igual a 3,2). Se observó asociación entre concentraciones de anticuerpos anti-PFC superiores a 40 U/mL y la actividad clínica moderada o elevada (x²= 4,3; OR = 4,4; IC = 1,2-16,4; p = 0,0382), con una prevalencia en expuestos de 96,1 %.

De manera similar fue la relación observada entre la proteína C reactiva y las concentraciones de anticuerpos anti-PFC (Fig. 2). De un total de 107 pacientes con proteína C reactiva positiva, 65 (60,7 %) tuvieron anticuerpos a concentraciones superiores a 40 U/mL y solamente 11 pacientes (26,8 %) de 41 negativos de proteína C reactiva. Se demostró asociación entre la presencia concentraciones de superiores a 40 U/mL de anticuerpos anti-PFC y la positividad de proteína C reactiva en los pacientes con AR (x²= 13,7; OR = 4,2; IC = 1,9-9,3; p = 0,0002) y una prevalencia en expuestos de 85,6 %.

DISCUSIÓN

La mayoría de los pacientes incluidos en el estudio fueron del sexo femenino. Es conocido que el sexo femenino tiene de dos a tres veces mayor predisposición al desencadenamiento de enfermedades autoinmunes como la AR.⁽¹⁵⁾

Es evidente la relación existente entre el hábito de fumar y los cambios epigenéticos que pueden afectar el funcionamiento de las células vinculadas a la patogenia en la AR y que conducen a la generación de autoanticuerpos.^(7,11,15) De ahí la importancia de conocer la relación entre estos factores y la severidad de la enfermedad en pacientes cubanos con AR.

La asociación observada en este trabajo entre el hábito de fumar y la presencia de altas concentraciones de anticuerpos anti-PFC en pacientes con AR, coincide con investigaciones recientes en pacientes fumadores, que relacionan este factor al estrés oxidativo, a la inflamación y a la formación de autoanticuerpos.^(5,8,10,17)

El hábito de fumar es uno de los factores que más fuertemente se ha asociado al desencadenamiento de la AR en pacientes con predisposición genética.^(5,8,10)

Además, se ha planteado que los productos tóxicos del cigarro tienen efectos inmunomoduladores a través de cambios genéticos como mutaciones somáticas y de la línea germinal, pero fundamentalmente por mecanismos epigenéticos.^(8,18) Entre estos mecanismos se incluyen cambios en la actividad de las enzimas histona diacetilasa e histona acetilasa, lo cual produce un desbalance en el proceso de acetilación y desacetilación de las histonas, que lleva a la transcripción sostenida de genes de proteínas proinflamatorias, mediante reclutamiento de factores de la transcripción y la activación de vías de transducción señales. El cigarro también inhibe las vías de transducción de señales en las células T, que conducen a la reducción de la expresión de enzimas responsables de la metilación del ADN y a la activación de células autoreactivas.^(8,18)

Se han demostrado alteraciones en la metilación del ADN y la acetilación de histonas en los fibroblastos sinoviales de pacientes con AR.^(7,11,15) Estas células adquieren un fenotipo agresivo y son los mediadores primarios de la destrucción del cartílago, a través de la formación del tejido sinovial inflamado, además de la propagación de la inflamación articular con la secreción de citosinas, que favorecen la diferenciación y proliferación de los linfocitos B y, por tanto, la producción de autoanticuerpos.^(7,15,18)

Uno de los marcadores de la AR es el desarrollo de autoanticuerpos que reaccionan con proteínas citrulinadas. En estudios recientes se han detectado proteínas citrulinadas en el tejido sinovial de las articulaciones inflamadas de pacientes con AR, con alta especificidad para el diagnóstico como vimentina, enolasa y fibrinógeno.⁽¹⁹⁾ Estas proteínas son consideradas candidatos relevantes para el desencadenamiento de la autoinmunidad en individuos genéticamente susceptibles y se considera que su utilización para la determinación de anticuerpos en pacientes con AR, puede conducir a un incremento en el valor diagnóstico y pronóstico en la actualidad.⁽¹⁹⁾

El hábito de fumar ha sido asociado a la producción de anticuerpos que reconocen la enolasa, el fibrinógeno y la vimentina.⁽⁸⁾

Por otra parte, uno de los procedimientos más utilizados en la evaluación clínico terapéutica de estos pacientes es la utilización de índices que resumen la información de varios parámetros en un solo indicador, como el DAS 28.^(12,14) Asimismo, entre los factores presentes en el momento del diagnóstico, que pueden indicar un peor pronóstico, se encuentra la elevación de reactantes de fase aguda como la proteína C reactiva, que ocurre en condiciones inflamatorias y no es específica de la AR, pero correlaciona con la severidad de la enfermedad y con el daño radiográfico.^(12,14)

La asociación observada en este trabajo entre concentraciones elevadas de anticuerpos anti-PFC en pacientes con AR, lo sindicadores de severidad clínica DAS 28 y proteína C reactiva, confirma la vinculación de estos anticuerpos con la patogenia de la enfermedad.

En conclusión, el hábito de fumar está asociado a concentraciones elevadas de anticuerpos anti-PFC, que se asocian a una mayor severidad clínica de la enfermedad en pacientes cubanos con AR.

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Conflictos de intereses

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Contribuciones de los autores

Goitybell Martínez Téllez : contribuyó al diseño, planificación, desarrollo de la investigación y análisis de los resultados.
Bárbara Torres Rives : contribuyó diseño de la investigación y análisis de los resultados.
Yaima Zúñiga Rosales , Maité Martiatu Hendrich y Minerva Matarán Valdes: asistieron en el desarrollo de la investigación y análisis de resultados.

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